Q1. 細胞如何貼壁或者固定好？

這是第一步，也是基礎和關鍵的一步，這是基礎，基礎不好，后面一切都是白搭。

對于貼壁細胞: 先將潔凈的爬片片在 70%乙醇中進行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養皿中，用無菌 PBS 洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片(一般都是過夜培養)操作小心，防止細胞脫片。

對于懸浮細胞: 如果能像貼壁細胞一樣，那就好了。傳統這是一個痛點待解決，其實新的方法就是使用靶點科技（Biotarget）的懸浮細胞免疫熒光專用玻片。讓懸浮細胞簡單四步，就能像貼壁細胞一樣固定好，主要是，細胞還是活的，還可以刺激。

Q2. 如何避免多種染色互串？

*細胞不能鋪的太密，細胞稀釋一下，濃度不能太高，盡可能用大體積來鋪細胞。太密就導致一抗結合蛋白增多，更容易出現非特異性染色，且細胞太密，顯微鏡拍照出來的效果就會很一般，一般6孔板滿孔的貼壁細胞，取1/8的量鋪到帶有爬片的12孔板里，大概12小時后，細胞密度就剛剛好。懸浮細胞，直接用靶點科技的懸浮細胞免疫熒光專用玻片就行。雙抗體染色時可不用活細胞染核液（Hoechst），也就是不要最開始染核，放到最后封片時，用DAPI染，DAPI濃度不要過高，核很容易被染色，低濃度染色即可。

*支原體清除后再做IF。用狀態好，未被污染的細胞去做IF，狀態好的細胞伸展很開，染色效果也更好，若細胞支原體污染，可能會產生背景臟，圖像不完整等現象，非特異性染色嚴重且去不掉，染核染抗體都會被染上亂七八糟的東西。

*一抗濃度的問題。雙抗體染色若外轉質粒，可染標簽抗體，標簽抗體更特異且使用濃度低，一般都在1：500左右；若染內源性蛋白，濃度可1：200，做之前記得看下抗體說明書該抗體是否可以做IF；4度過夜染效果更好，一抗可回收，負20保存，大概可用3次，根據抗體靈敏度決定使用次數；雙抗體IF，一定要用不同來源的的抗體，一個用鼠，一個用兔，最好不要雙鼠或者雙兔的。

*二抗：常溫孵育1～2h，避光，避開同屬性的二抗，洗滌一抗可用pbs，洗滌二抗可以用tbst，多加一些吐溫。吐溫可以洗滌掉非特異結合的抗體，多洗幾次。

*拍攝：封片后拍攝時，可以適當縮短激發光波長，使其沒有交叉波長。比較好的選擇：綠光488，紅光555。重合的波譜，就會不單純激發。拍出來就不單純。